工作原理
人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）elisa試劑盒實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）水平。用純化的人高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1），再與 HRP 標(biāo)記的高遷移率族蛋白 B1（HMGB-1）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）濃度。
試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1瓶
2 酶標(biāo)試劑 6ml×1 瓶 8 標(biāo)準(zhǔn)品（320µg/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶標(biāo)包被板 12孔×8 條 9 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1份
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2張
6 顯色劑B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1個
標(biāo)本要求
1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作流程
人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA試劑盒操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。
160µg/L 5號標(biāo)準(zhǔn)品 150µl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
80µg/L 4號標(biāo)準(zhǔn)品 150µl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
40µg/L 3號標(biāo)準(zhǔn)品 150µl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
20µg/L 2號標(biāo)準(zhǔn)品 150µl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
10µg/L 1號標(biāo)準(zhǔn)品 150µl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150µl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，然后再加待測樣品10µl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50µl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50µl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
操作程序總結(jié)：


計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA試劑盒注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
儲存方式
人高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA試劑盒保存條件及期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．期：6個月

更新時間：2024/10/8 9:18:31